维生素一直是国内外生物医学领域的研究热点。但由于发酵单元低、工艺复杂、维生素加工时间长，难以大幅度提高产量。目前全球产量超过吨。生产商主要在美国和德国。虽然维生素在国内生产已经很长时间了，但目前年产量仅为吨。主要生产企业有华北制药集团、石药集团，除了中药集团生产规模大，其他厂家的产量都很小，所以未来发展空间很大。近两年来，国内采用丙酸芽孢杆菌发酵技术引进生产维生素的厂家仅少数，但发酵水平与国外先进水平仍有较大差距。因此，利用优良的菌种和优化的发酵条件大规模生产维生素是一项具有广阔应用前景的技术。为了扩大维生素的研究领域，促进维生素的工业化生产，有必要对维生素高产菌株的选育和发酵过程进行研究。维生素具有多种生物功能，市场需求量大，因此提高其产量十分重要。微生物生物合成维生素是一种非常经济有效的获取大量维生素的途径，需要优良菌株的高产和高效的合成条件。目前，对维生素生物合成条件的优化研究较少。代谢抑制是一种合理的筛选方法，可以有效地筛选出符合要求的阳性突变体。预计该方法也能成功筛选出维生素产量高的突变株。基因组重组可以通过融合具有不同遗传背景的阳性突变株产生新的复杂后代。此外，这些菌株经常消除负突变，并将多个正突变整合为一个。因此，在很大程度上弥补了经典诱变方法的缺陷，可以筛选出具有较好的性状的菌株。通过双向电泳可以发现基因组重组获得的维生素菌株在发酵过程中与原亲本菌株胞内蛋白表达的差异，为进一步研究丝状芽孢杆菌生产维生素找到差异蛋白。简而言之，我们将从一种维生素生产菌株的基因组中重组维生素对生物合成条件和发酵工艺参数的设计进行了逐步优化，提高了维生素的产量，为工业生产维生素提供了稳定的高产植株，满足科研生产的需要。第二章丝氨酸丙酸杆菌产维生素菌株的筛选本实验室保存了一株丝氨酸丙酸杆菌。含有液体种子的甘油，每月一次储存在离心管中。培养基种液培养基及培养条件自来水中葡萄糖酵母菌浸膏。自来水中葡萄糖玉米浆二甲苯并咪唑的发酵培养基及培养条件。自来水中葡萄糖酵母膏琼脂的半固态培养基及培养条件。自来水琼脂培养基中葡萄糖抗性酵母抽提物b蛋氨酸从四氯化碳购买亚硝基胍丙酸试剂公司从中山大学购买磺酸乙酯硕士纸公司在美国购买的维他命日本成从上海“生物科技有限公司”分批装运。B从云雀化学试剂公司购买蛋氨酸，其他化学试剂均为国产分析试剂。双向电泳仪仪器冷冻离心机德国紫外分光光度计日本公司有美国公司单面双面清洗台苏州净化设备有限公司恒温表中国科学院武汉科仪器厂立式压力蒸汽灭菌锅广州医疗器械厂生化培养箱江苏扬州三毛电子有限公司采用德国公司化学试剂配制的上海射线磁性发酵罐，用蒸馏水分别配制，再与溶液按比例混合。维生素提取物的制备将固体溶解到蒸馏水[]中制成母液，再用该溶液将母液稀释到提取物的浓度。实验方法谢世冰中山大学种子培养硕士学位论文研制的配置种子液体培养液培养基调整为下拉冷藏恒温培养箱中静态配置培养发酵液发酵培养基调整为接下来吸取小时种子液到液体体积中，在恒温培养箱中静态培养半固体配置调整小时种子半固体培养基稀释双浓度未凝固的半固体培养基均匀摇匀，然后倒入直径试管中。放置垂直恒温培养箱进行抗性筛选培养。调节抗性培养基，一小时可稀释种子液数百万倍浓度将未凝固的抗性培养基摇匀后，倒入直径试管中，垂直置于恒温培养箱中培养维生素含量。采用改进的提取方法进行实验室提取和测定维生素含量。离心后，将上清移入另一离心管中，加入苯甲醇，盖上离心盖，提取上苯甲醇溶液，在另一离心管中重复上述操作。然后将氯仿蒸馏水吸收加入提取的苯甲醇溶液中，用离心管盖住，提取后摇匀，提取上馏水，重复操作。最后得到了单氰态的维生素。条件下单位的维生素含量在发酵液体维生素稀释率计算公式如下高产突变株诱导诱变育种的诱导复合诱变引起致命的生产曲线了解亚硝基胍致命效果维持剂量的函数恒定时间的变化来确定合适的诱变条件，以确保在较小的范围内筛选得到较高的诱变菌株机。诱变的基本操作是:溶解在丙酮中备用。取种液离心，在灭菌的磷酸缓冲液中悬浮两次。加入丙酮母液，定时诱变，离心，分别洗涤三次。计算各试管中生长的单个菌落数，并计算不同诱变时间下的死亡率。选择死亡率介于两者之间的菌落进行下一步的抗性筛选。诱导死亡曲线生产为了回报磺酸乙酯保持谢Shibing酸杆菌的致命剂量的影响随着时间不断变化的函数来确定适当的诱变条件以确保在小范围的筛选是获得更高的突变株。中山大学硕士论文诱导的基本操作如下是丙酮溶解。备用。将种子液悬浮在灭菌的磷酸缓冲液中，离心洗涤三次。加入一个丙酮母液，诱导离心，定时洗涤三次。将种子溶液在未凝固的半固态培养基中稀释至浓度的100万倍为了避免可见光对细菌的光复活效应，在黑暗的超净工位中进行红光制线。诱变的基本操作是:离心，洗涤，悬浮在灭菌磷酸缓冲液中两次，洗涤，吸收菌液，加入到直径的灭菌磷酸缓冲液中，启动磁力搅拌器，缓慢搅拌。同时记录紫外灯液位与灯管的垂直距离。在相应的时间内进行诱变，并在未凝固的半固态培养基中稀释至100万倍浓度。其他步骤与诱变相同。诱变致死曲线的制备诱变的基本操作为:溶于丙酮中使用。将种子溶液离心，洗涤，悬浮在灭菌的磷酸缓冲液中。加入丙酮母液诱变和吸收菌液，加入直径为灭菌的磷酸缓冲液，启动磁力搅拌器缓慢搅拌并记录刻度。同时记录紫外灯液位与灯管的垂直距离。同时取出菌液，在未凝固的半固态培养基中稀释至100万倍浓度，其他步骤同诱变。溶于c中山大学酮备用。将种子溶液离心，洗涤，悬浮在灭菌磷酸盐缓冲液中三次。加入丙酮母液、诱变吸菌液，加入已灭菌的磷酸缓冲液直径内，启动磁力搅拌器缓慢搅拌，记录刻度。同时记录紫外灯液位与灯管的垂直距离。同时取出菌液，在未凝固的半固态培养基中稀释至100万倍浓度，其他步骤同诱变。当确定了适宜的诱变剂量和诱变时间后，可在半固态培养基中加入维生素抗性筛选剂。将在含抗性物质的半固态培养基中生长的单个菌落挑出，在含种籽液的日子后进行培养。然后将接种量接种到装有种籽液的摇瓶中进行静态培养。将接种量接种到装有发酵液的摇瓶中进行静态培养，离心收集细菌