植物启动子基因的克隆，37个Takara测序克隆载体命名为pMD18T ACT2。拟南芥基因组DNA诱导启动子的克隆拟南芥基因组的提取拟南芥基因组的方法与玉米基因组的方法相同。以拟南芥DNA为模板引物Rd1和Rd2进行PCR扩增的拟南芥高耐盐、耐低温和耐旱启动子的克隆PCR反应体系按上述PCR反应步骤94预扩增4 min 94 30s52 30s72 50s35循环72延伸10min扩增产物命名为Rd29A回收、连接、转化、检测并送Takara公司测序克隆载体命名为pMD18T Rd29A。从水稻基因组中克隆肌动蛋白启动子以Ac1和Ac2为引物，通过PCR扩增1400bp片段，并将其插入到克隆载体中。测序结果表明，克隆的启动子长度为1419bp，与Act1启动子登录号S44221的同源性为95，但中间序列比Act1长140bp。本实验克隆的启动子序列实际上是水稻肌动蛋白的启动子序列，其5'非编码区8551为启动子区，TATA框架位于4133区，5'非编码区包括第一外显子90、第一内含子91551和第二外显子部分序列552564，顺式作用因子区和反式调控区分别位于186140区和267300区，其中5'非编码区结构域可大大增强谷类作物的启动子活性。具体分析如图3所示。3.将片段命名为Act2 GenBank登录号EU155408。玉米泛素Ubi1启动子的克隆Fig riceActin启动子Fig maizeUbi 000DNA MArker DNAMarker3序列测定及38个肌动蛋白分析玉米泛素Ubi1启动子的克隆；从玉米基因组DNA中扩增出的启动子片段Ubi1约为1992bp，与GenBank中报道的Ubi1启动子序列同源性为http://www.zhucesz.com/。该片段包含UBI1启动子序列及其5'非编码区。1,904 bp的启动子区包含正确的TATA盒和两个与启动子热激元件序列同源的部分重叠序列，这些序列与逆境条件下泛素启动子活性增强有关。此外，U元素GCTGT与启动子的强启动效率密切相关。克隆的启动子序列中有4个CACGGCA序列，可能是顺式作用元件，它们的强弱决定了基因的转录水平。拟南芥Rd29A启动子的克隆在本实验中，我们还克隆了拟南芥逆境诱导的Rd29A启动子，该启动子全长951bp，与原序列同源性大于http://www.zhucesz.com/,包含TATABox,CAAT box等完整功能域，与逆境应答相关的DRE脱水应答元件顺式作用元件序列为TACCGACAT。Rd29A基因启动子是一种应激诱导启动子。启动子只能在干旱、高盐、低温等胁迫下驱动目的基因在植物细胞中的表达。植物启动子基因39的克隆拟南芥Rd29A启动子克隆无花果拟南芥Rd29A启动子000DNA标记综述启动子的表达效率是影响转化率及转基因植株产量和品质的重要因素之一。因此，高效启动子是我们的转基因过程中最有利的研究工具。玉米泛素启动子Ubi和水稻肌动蛋白启动子Act1在单子叶植物中应用广泛。水稻肌动蛋白基因启动子最早由McElroy等人研究。从水稻基因组中分离的Act1基因是一个高效启动子。在转基因转移过程中，基因在转化体中往往以多拷贝的形式存在，其中一些会发生重排。外源基因的多拷贝是基因沉默的主要原因。基因沉默通常是由顺式失活、反式失活以及转移基因的不同拷贝之间或转移基因与同源内源基因之间的相互抑制引起的。有报道称，在转基因玉米中应用玉米启动子可以减少拷贝数，避免同源序列重组整合到水稻基因组中，进而减少基因沉默。因此，在转基因水稻中应用水稻启动子是减少基因沉默的好方法之一。本实验通过克隆水稻肌动蛋白亚基因，研究其活性，为转基因水稻提供材料和依据。在本实验中，我们还克隆了一个干旱诱导启动子，该启动子没有器官特异性，在干旱、寒冷、盐等胁迫下诱导产生。诱导启动子可在逆境条件下表达大量目的基因以提高水稻抗性。潮霉素抗性41模板材料植物表达载体pCAMBIA1301的Hyg基因克隆。引物设计根据潮霉素基因在GenBank上的登录号AF234297,用Primer Premier 0编程软件设计出Hyg1和Hyg2的引物序列为:Hyg1 CCCATGGATGAAAAAGCCTGAACTCACCG Hyg25个末端标记有Sma酶切位点的点和线。以植物表达载体pCAMBIA1301为模板引物，Hyg1和Hyg2进行PCR扩增，PCR反应体系为3PCR反应程序94预扩增4 min94 50s57 1min72 1min35循环72延伸10min，扩增产物命名为Hyg。结果与分析PCR扩增出一个1000bp的片段进行测序。结果表明，克隆的抗性基因长度为1026bp，与原序列同源性为http://www.zhucesz.com/。在282位有一个碱基G到T的突变，但核苷酸序列不变。碎片被命名为HYG。DNAMarker3 Fig hyggene42小结本实验克隆的潮霉素抗性基因的氨基酸序列与原序列完全一致，证明该基因功能正常，可用于抗性筛选。筛选中使用的一个抗生素耐药基因会对不同的抗生素产生耐药，对敏感细胞和转化细胞产生不同的有害影响，从而影响转化效率。应选择对敏感细胞伤害较大、对转化细胞伤害较小的抗生素作为筛选剂，以保证更高的转化效率和更高的筛选效率。不同的单子叶植物有不同的适宜筛选剂。常用的npt基因筛选剂是卡那霉素。在谷类作物中，实验证明筛选剂潮霉素对hpt基因106和G2418对npt基因107的筛选效果良好。采用巴罗霉素对小麦npt基因进行转化。潮霉素抗性基因HPT是从大肠杆菌中克隆和修饰的筛选标记，广泛应用于水稻遗传转化。该筛选标记可区分转化细胞和非转化细胞，且不引起再生植株白化和不育。但品种间内源潮霉素抗性存在差异；潮霉素抗性标记筛选前，需要对特定品种进行梯度试验，确定合适的选择压力，这样可以有效区分转化细胞和非转化细胞，避免影响转化细胞的再生。挪威小鼠HSPA4植物表达载体的构建与鉴定。四川省农业科学院生物技术与核技术研究所保存了43份材料的植物表达载体pCAMBIA1301和pBI121。限制性内切酶Hind III、Bam HI、Nco I、Sac I、Sma和Sac及相关缓冲液，T4 DNA连接酶购自Takara生物公司DNA标记3购自广州东升生物科技有限公司。植物表达载体pCAMBIA1301Act2 GUS的构建Nco和Sal质粒pCAMBIA1301和PMD18T Ac2的酶切体系如下。Nco,pMD18TAc2,无菌水,上20μL,大片段在pCAMBIA1301中,小片段在PMD18T Ac2中,16个连接过夜连接反应液在70以上。取出一管容量为100μL的大肠杆菌DH5α，冰上融化。将所有连接反应液加到冰浴中的DH5α感受态细胞中30min。取出后加入900μL LB培养基37，170r min。在振动台中取出1h。取出100μL、200μL、300μL菌液，涂于含50μg mL kan的LB固体培养基上37培养过夜。在含50μg mL kan的LB液体培养基中，培养37220r min。用自制试剂提取质粒，经PCR和Nco Sal双酶切鉴定。重组质粒命名为pCAMBIA1301 Ac2 GUS。构造过程如图5所示。可用于检测启动子活性或进一步构建载体。植物表达载体pCAMBI构建A1301Act2 GUS Fig植物表达载体pCAMBIA1301ACT2 GUS植物表达载体pBI121Ubi GUS,构建Hind III和Bam HI双酶切质粒pBI121和PMD18T Ubi消解体系。Hind III pMD18TUBI无菌水上升20μL,分别回收了pBI121大片段和PMD18T Ac2小片段。将16个连接和过夜连接的反应液转化为大肠杆菌DH5α中的卡那霉素阳性克隆。植物表达载体45的构建与鉴定。构建植物表达载体pBI121 Ubi GUS图5构建植物表达载体pBI121 Ubi GUS构建植物表达载体pCAMBIA1301RD29AGUS Nco I和Sac I双酶切质粒pCAMBIA1301和pMD18TRD29A消解系统如下。分别回收Nco、pMD18TRd29A无菌水UP20μL和PMD18T Ac2小片段16连接反应液，转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素阳性克隆。PCR和NcoI SacI酶切鉴定重组质粒pCAMBIA1301UBI，如图5所示。3植物表达载体pCAMBIA1301Rd29A的构建载体pCAMBIA1301 Rd29A GUS植物表达载体pCAMBIA1301Ubi Hspa4构建Sal和Stu双酶切pMD18T P12和pMD18T P34回收含有载体部分的pMD18T P12小片段和pMD18T P34大片段，结合转化氨苄西林阳性克隆提取质粒pMD18T Hspa4 BstP和Sal双酶切质粒pCAMBIA1301 BstP,Sal和Sca分别消化pMD18T Hspa4获得一个大片段pCAMBIA1301并与pMD18T Hspa4 2500bp连接。卡那霉素筛选阳性克隆的中间表达载体命名为pCAMBIA1301HSPA4。用SMA和Sac对PMD18T Ubi和pCAMBIA1301 Hspa4进行双酶切，分别得到约2000bp的Ubi片段和pCAMBIA1301 Hspa4的大片段